編者按

中國農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所陳愛亮教授，研究方向主要為基于現(xiàn)代生物分析技術(shù)的食品質(zhì)量安全快速檢測、鑒別與溯源方法研究及產(chǎn)品研發(fā)等， 利用我司生產(chǎn)的微芯片實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在食品安全領(lǐng)域進(jìn)行了大量科學(xué)研究，建立了一種基于芯片PCR的快速鑒別羊肉摻假成分的方法，其科研成果發(fā)表在《生物技術(shù)進(jìn)展》2018年的第6期，特此向陳老師表示致敬，以下為陳老師發(fā)表文章《羊肉摻假鑒別快速熒光定量 ＰＣＲ 芯片制備及應(yīng)用研究 》節(jié)選~~

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高，我國居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了重大的變化火鍋、羊肉串等備受喜愛。然而，目前羊肉制品摻假現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重。常見的摻假肉類主要包括豬肉、雞肉、鴨肉等有的甚至還會(huì)摻入鼠肉， 這種欺詐行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者權(quán)益，同時(shí)對(duì)社會(huì)發(fā)展帶來了消極影響。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種肉品摻假檢測技術(shù)主要包括以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附、色譜質(zhì)譜技術(shù)以代謝物為基礎(chǔ)的紅外光譜技術(shù)和以核酸為基礎(chǔ)的ＰＣＲ檢測技術(shù)等，其中應(yīng)用多的為基于熒光定量ＰＣＲ的檢測技術(shù)但是現(xiàn)有技術(shù)所需時(shí)間較長，無法滿足現(xiàn)場快速鑒別的要求。同時(shí)，以羊肉串摻假為例，其摻假的肉類品種可能有豬肉、雞肉、鴨肉、甚至老鼠肉等。如果逐個(gè)對(duì)可能的摻假物種進(jìn)行ＰＣＲ檢測則存在操作繁瑣、分析時(shí)間長等問題。 

近年來，芯片式快速熒光定量ＰＣＲ技術(shù)的發(fā)展為羊肉摻假鑒別等核酸檢測提供了一種快速多重的熒光定量ＰＣＲ檢測方法其是一種將芯片技術(shù)與熒光定量ＰＣＲ技術(shù)相結(jié)合的高新生物技術(shù)。傳統(tǒng)的微芯片技術(shù)是運(yùn)用微電機(jī)系統(tǒng)技術(shù)通過制作微管道等空間結(jié)構(gòu)及微加熱等控制結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)芯片上的快速ＰＣＲ擴(kuò)增而本研究通過將引物、反應(yīng)所需試劑預(yù)先凍干固定到芯片上只需將模板滴加至微孔內(nèi)即可進(jìn)行擴(kuò)增同時(shí)利用微芯片實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀實(shí)現(xiàn)通過熒光信號(hào)檢測ＰＣＲ產(chǎn)物該技術(shù)也可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)(植物病 原菌檢測、轉(zhuǎn)基因鑒別)、畜牧(牛類病害鑒別、魚 類和家禽病原菌檢測)、食品安全(病原菌鑒別、微生物腐*鑒別)、生命科學(xué)和醫(yī)療(人類疾病鑒別、人類基因檢測)等領(lǐng)域。

為了建立一種基于芯片PCR的快速鑒別羊肉摻假成分的方法，將不同動(dòng)物源性成分的引物及反應(yīng)所需試劑預(yù)先凍干固定到空白芯片反應(yīng)池內(nèi)，以制備羊肉摻假鑒別快速熒光定量ＰＣＲ芯片，同時(shí)通過模擬摻假樣品(在羊肉中摻入豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉成分)檢測實(shí)驗(yàn)，對(duì)所得芯片的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。從與ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果對(duì)比可知，基于芯片的快速熒光定量ＰＣＲ檢測方法可以準(zhǔn)確檢測５種動(dòng)物源性成分，具有較高的準(zhǔn)確性及可用性，且其ＰＣＲ擴(kuò)增時(shí)間較短，操作簡單，滿足了羊肉摻假快速鑒別的要求，該芯片的研制及快速檢測方法的建立將有效的簡化羊肉制品摻假檢測的步驟、縮短檢測時(shí)間，且成本較低，儀器便于攜帶，使現(xiàn)場檢測成為可能，研究結(jié)果為我國肉類食品安全監(jiān)管提供了有力保障。

１.１　 材料與試劑 

羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉均購自北京市農(nóng)貿(mào)市 場?鼠肉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，二甲基亞砜、牛血清白蛋白、海藻糖等均購自北京雁棲灣生物技術(shù)有限公司

１.２　 實(shí)驗(yàn)儀器 

７５００熒光定量 ＰＣＲ 儀(美國 ＡＢＩ 公司)

ＡｒｉａＤＮＡ-１０便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀 (ＬＵＭＥＸ 分析儀器公司)等

１.３　 樣品制備 

用電子天平稱取羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉各２０ｍｇ，用于提取引物特異性實(shí)驗(yàn)所用模板，再按照不同重量百分比(表１)分別稱取不同肌肉組織進(jìn)行混合作為模擬摻假樣品(每份樣品為２０ｍｇ)，總摻假比例為０~８０％。

１.４　 ＤＮＡ 的提取及檢測 

按照ＴＩＡＮａｍｐＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ說明書提取制備好的樣品的基因組ＤＮＡ，采用超微量分光 光度計(jì)對(duì)提取的ＤＮＡ進(jìn)行濃度及純度檢測? 其 濃度為１０~２０ｎｇ/μＬ，且純度較高(Ａ２６０/Ａ２８０為 １.８~１.９，Ａ２６０/Ａ２３０>２.０)，因此可用于后續(xù) ＰＣＲ 擴(kuò)增。

１.５　 引物特異性實(shí)驗(yàn)

研究所用引物均由北京生工生物技術(shù)有限公司合成，為了確定引物特異性 在ＡＢＩ７５００儀器上分別用羊源、豬源、雞源、鴨源與鼠源成分的特異性引物對(duì)５種肉的基因組 ＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)體系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ １０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４μＬ，模板 ２ μＬ剩余用無菌去離子水補(bǔ)齊反應(yīng)程序:９５℃ ５ ｍｉｎ９５℃ ３ ｓ６０℃ ３２ ｓ共 ４０ 個(gè)循環(huán)；７２℃ ２ ｍｉｎ 添加熔解曲線。通過擴(kuò)增Ｃｔ 值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán) 數(shù))來判斷引物的特異性，Ｃｔ<３５為有效擴(kuò)增Ｃｔ ≥３５為無效擴(kuò)增。

１.６.１ 芯片的制備　 

本研究的空芯片微陣列設(shè)計(jì)為５×６陣列，每個(gè)位點(diǎn)包含凍干固定的一對(duì)引 物(表３)及反應(yīng)所需試劑。反應(yīng)體系(２０μＬ):２×ＰＣＲＭｉｘ１０μＬ１０ｍｏｌ/Ｌ正、反向引物各０.４ μＬ，剩余體積用無菌去離子水補(bǔ)齊，同時(shí)將５μＬ ０.５ｇ/ｍＬＤＭＳＯ、１.６５~１.９５ｍｇ保護(hù)劑ＢＳＡ、０.６~ １.２ｍｇ賦型劑海藻糖與２０μＬ反應(yīng)體系進(jìn)行混合，隨后取２μＬ混合溶液滴加到芯片上，采用 凍干機(jī)進(jìn)行凍干(－４０℃冷凍 ２ ｈ)，置于４℃ 備用。

１.６.２　 芯片式ＰＣＲ反應(yīng)　 

將２μＬ模擬摻假樣品 １、２、３、４、５的基因組ＤＮＡ分別滴加到芯片的第 １、２、３、４、５列的反應(yīng)池內(nèi)，第６列為陰性對(duì)照，即不含任何模板。然后用６４０μＬ礦物油將液體覆蓋，以免高溫蒸發(fā)，此方法無需繁瑣的配制體系與 操作步驟，簡單快速?，反應(yīng)程序:９５℃５ｍｉｎ，９５℃ ３ｓ?６０℃３２ｓ，?共４０個(gè)循環(huán)；７２℃ ２ｍｉｎ： 添加熔 解曲線。

２.１　 引物特異性實(shí)驗(yàn) 

引物的特異性是動(dòng)物源性成分核酸檢測技術(shù)的關(guān)鍵，本研究利用篩選出的羊源、豬源、鴨源、雞 源與鼠源性成分的特異性引物對(duì)５種肉的基因組ＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增。用羊源性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除了羊源ＤＮＡ出現(xiàn)擴(kuò)增且所對(duì)應(yīng)的 熔解曲線均為單峰外，其他物種模板均無擴(kuò)增且 熔解曲線為平滑的一條直線，說明羊源性引物的特異性較好； 豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物與羊 的結(jié)果一致，表明５對(duì)引物特異性好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

２.２　 自制多重 ＰＣＲ芯片檢測模擬羊肉摻假樣品結(jié)果 

本研究利用自制的羊肉摻假鑒別多重 ＰＣＲ 芯片以及ＡｒｉａＤＮＡ-１０便攜式微芯片實(shí)時(shí)熒光定 量ＰＣＲ儀對(duì)５種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測。各靶標(biāo)的擴(kuò)增Ｃｔ 值和擴(kuò)增曲線分表見下表和下圖。 

結(jié)合芯片式ＰＣＲ和ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ 的結(jié)果可知：本研究所建立的擴(kuò)增體系中在ＡｒｉａＤＮＡ-１０儀器上用芯片進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)和ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ檢測方法的結(jié)果高度一致，２種方法均能準(zhǔn)確的檢測出５種成分，且隨著動(dòng)物源性成分含量的減少相應(yīng)的Ｃｔ值會(huì)逐漸增加。要注意的是本研究無法通過Ｃｔ 值進(jìn)行定量檢測只能進(jìn)行定性檢測，即確定含有哪種成分的摻假。

根據(jù)５種模擬摻假樣品的成分配比可知，每個(gè)樣品中均含有羊源性成分。因此，采用羊源性引物對(duì)５種模擬摻假樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，共５條擴(kuò)增曲線(圖２Ａ)。 同理。豬源、雞源、鴨源與鼠源性引物的位置分別出現(xiàn)４條、３條、２條與１條擴(kuò)增曲線，結(jié)果與已知樣品中所含成分保持一致。由于在實(shí)際應(yīng)用中若摻假比例太低，則獲利微薄。因此，本研究將低摻假比例設(shè)為２０％，未對(duì)含量更低的樣品進(jìn)行檢測，從圖２可以看出利用自制的ＰＣＲ芯片對(duì)５種模擬摻假樣品進(jìn)行檢測均可檢測到相應(yīng)的動(dòng)物源性成分，定性檢測準(zhǔn)確率 為１００％。同時(shí)，擴(kuò)增曲線表明自制的ＰＣＲ芯片具有較好的擴(kuò)增效率，而且隨著動(dòng)物源性成分含量的降低，相應(yīng)的Ｃｔ 值逐漸增大。

本研究建立了基于芯片的快速熒光定量ＰＣＲ檢測方法與傳統(tǒng)的熒光定量ＰＣＲ相比，ＰＣＲ芯片一般由５×４或更多的反應(yīng)池組成可實(shí)現(xiàn)樣品多指標(biāo)的檢測。由于芯片式ＰＣＲ預(yù)先將反應(yīng)所需試劑和引物凍干保存只需將提取的ＤＮＡ模板滴加到芯片上即可進(jìn)行擴(kuò)增簡化了檢測步驟、縮短了檢測時(shí)間。通過與ＡＢＩ７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果具有一致性，均可準(zhǔn)確的檢測出５種成分且Ｃｔ值均隨著動(dòng)物源性成分比例的減少而升高。目前，已有很多關(guān)于利用ＰＣＲ技術(shù)檢測肉制品中摻假成分的報(bào)道Ｐｒｕｓａｋｏｖａ等采用多重ＰＣＲ擴(kuò)增法可同時(shí)鑒別肉類產(chǎn)品中５種常見的摻假肉類。每種肉類的檢測靈敏度可達(dá)３０ｐｇＤａｌｓｅｃｃｏ等采用熒光定量ＰＣＲ的方法可以檢測１０種不同的動(dòng)物源性成分?利用該方法對(duì)４６種實(shí)驗(yàn)肉品混合物進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示所有品種均鑒定正確檢測靈敏度為１％同時(shí)對(duì)１４種商業(yè)的肉類產(chǎn)品進(jìn)行分析結(jié)果表明１４個(gè)樣品中有６個(gè)含有雞肉原料，由此可知，該方法對(duì)肉類產(chǎn)品的分析是有效和可靠的，普通ＰＣＲ雖然操作簡單、成本較低，但是對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測所需時(shí)間較長而傳統(tǒng)的熒光定量ＰＣＲ一般需要２ｈ才能完成，不適用于現(xiàn)場檢測。本研究所建立的芯片式熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增法，由于所需樣本體積小(只需２μＬ)ＰＣＲ升降溫反應(yīng)速度快，可縮短至３０ｍｉｎ完成擴(kuò)增及數(shù)據(jù)收集，操作簡單，實(shí)驗(yàn)周期短。該芯片的研制及快速檢測方法的建立將有效的簡化羊肉制品摻假檢測的步驟、縮短檢測時(shí)間，同時(shí)所用芯片檢測儀器Ｌｕｍｅｘ體積較小，攜帶方便為現(xiàn)場檢測提供了技術(shù)支撐。